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滤泡辅助性T细胞染色技术

简介

滤泡辅助性 T 细胞 (T follicular helper cells, Tfh) 染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行染色，以进一步深入研究该群细胞的表型和功能。

原理

滤泡辅助性 T 细胞染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析，以鉴定 Tfh，便于进一步深入研究该群细胞的表型和功能。Tfh 是新近确定的一个 CD4+T 细胞亚群，其表面标志是表达 CD4 和趋化因子受体 CXCR5(CD3+ CD4+ CXCR5+)。 Tlh 是辅助 B 细胞发挥体液免疫应答效应的主要细胞亚群。

材料与仪器

器材：

流式细胞仪、单染管、离心机

试剂：

① 荧光标记的特异性单克隆抗体及同型对照抗体；

②细胞洗液。含 2% BSA、0.2% NaN3 的 PBS，固定液（1% 多聚甲醛 PBS，pH7.2）；

③人丙球蛋白。

耗材：

流式专用样品管、玻璃管

步骤

滤泡辅助性 T 细胞染色技术的基本过程可分为如下几步：

（1）人外周血单个核细胞（PBMC）分离。

（2）用流式洗液调整 PBMC 悬液密度为 2 x 108 L-，取 25μl 细胞悬液加入 1 μg 人丙球蛋白，室温封闭 15 min。

（3）加入 10 μl Percp-CXCR5 mAb，4 ℃ 孵育 30 min。

（4）同时加入 FITC-CD4 及 PE-CD19 mAb 各 20 μl，对照管分别加入各色的同型对照 mAb，各色单染管用于补偿调节，4 ℃ 孵育 30 min。

（5）每管加入 PBS 洗液 3 ml，1500 r/min 离心 5 min，弃上清。

重复洗 1 遍，加入 400 μl 流式固定液悬浮细胞，上机检测。

（6）所有样品用 BD FCS Calibor 进行分析，用 488 nm 激发光，前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）以线性信号收集。FSC-SSC 散点图上圈出单个核细胞群，用补偿管调节消除各色之间的荧光重叠，检测各色荧光强度，测定时各荧光通道均以相应同种型（isotype）IgG 染色细胞作阴性对照。

注意事项

1. 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

2. 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

常见问题

判定结果时，为使免疫荧光的定量分析更精确，注意减去本底荧光，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

文章来源: 丁香实验

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