简介
若在同一标本中有 A 和 B 两种抗原需要同时显示，A 抗原的抗体用 FITC 标记，B 抗原的抗体用 TRITC 标记，可采用免疫荧光细胞化学双重染色法。
材料与仪器
原代培养胚胎，14 天大鼠端脑细胞，FITC，TRITC
步骤
原代培养胚胎 14 天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白的诱导下，乙酰胆碱转移酶（呈绿色荧光）和同源域蛋白 Islet―1（呈红色荧光）共存于细胞质内（激光扫描共聚焦显微镜观察）。
1、一步双染色法先将两种荧光标记抗体按适当比例混合（A + B），按直接法进行染色。
2、二步双染色法先用 TRITC 标记的 A 抗体进行免疫荧光染色，再用 FITC 标记的 B 抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果 A 抗原呈现橘红色荧光，而 B 抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和 SABC-Cy3 法相结合。
例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠 A 和兔抗大鼠 B 作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为 FITC-抗小鼠 IgG 和生物素化―抗兔 IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。
孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔 IgG（二抗）孵育，洗涤后，滴加 SABC-Cy3 复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行 FITC―抗小鼠 IgG（二抗）的孵育，最 后封片观察。其结果 A 抗原呈现绿色荧光，B 抗原呈现红色荧光。
注意事项
双重染色法免疫荧光组织化学染色应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第 一种一抗和第 一种荧光二抗对 A 抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对 B 抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。
